印迹杂交


在基因操作中,把DNA或RNA、蛋白质等在薄膜滤器上先经浸润,固定后,于薄膜滤器上进行杂交,生成杂种分子。为基因操作中最常用的技术。
印迹杂交
印迹杂交,是基因诊断技术的一种,有多种方式,第一种是Northern印迹杂交,是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。第二种是Southern印迹杂交,是由凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段。第三种是Western印迹杂交,是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜(blot)上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
分析对象
Northern杂交用于分析RNA;Southern杂交用于分析DNA;
Western杂交用于分析蛋白质。
大致过程如下:
(1) 酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。
(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
Northern杂交
主要用于分析RNA,包括正向杂交、反向杂交、斑点杂交。
DNA印迹实验方法
DNA印迹实验方法
正向Northern杂交是将待测RNA固定在纤维膜上,用特异序列DNA探针与其杂交,再显影观察。
反向Northern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上,用待测RNA做成探针与其杂交,再显影观察。
Southern杂交
主要用于分析DNA,也包括正向杂交、反向杂交、斑点杂交。
正向Southern杂交是将待测DNA固定在纤维膜上,用特异序列DNA探针与其杂交,再显影观察。
反向Southern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上,用待测DNA做成探针与其杂交,再显影观察。
Western杂交
主要用于分析蛋白质,利用了抗原抗体特异性结合的原理。分为抗原法、夹心法、竞争法。
抗原法是将待测抗原固定在膜上,加特异抗体与其结合、洗膜、显色、观察。
夹心法是将一抗固定在膜上,加待测抗原、洗膜、加特异二抗、洗膜、显色、观察。
竞争法是分对照和试验两组,对照组将特异抗原固定在膜上,实验组将待测抗原固定在膜上,都加入特异抗体,显色、观察。用于比较抗原的特异性。
Northern印迹杂交
Northern印迹杂交(Northern blot)。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建,称为Southern印迹技术,RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
Northern印迹杂交由Southerm印杂交法演变而来,其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上,进行杂交反应,以鉴定基因中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度。
Southern印迹杂交
Southern印迹杂交(Southern blot)1975年由英国southern创建。
Southern印迹杂交示意图
Southern印迹杂交示意图
英文解释:use a DNA or a RNA probe to hybridize with DNA from a genome to detect whether there is/are the homologue DNA.
Southern印迹杂交是由凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段,将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定,再与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应,用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(RELP)等。[1]
Western印迹杂交
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot WB)是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜(blot)上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

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